Purification de fragments d’ADN humain contenant une zone de réparation par excision

Groupe CRM en science des radiations, Département de médecine nucléaire et de radiologie, Faculté de médecine, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec J1H 5N4, Canada.

Résumé

Dans le but d’étudier la réparation de l’ADN dans des séquences spécifiques du génome humain, nous avons développé une méthode pour purifier des fragments d’ADN contenant une zone de réparation par excision. Le principe consiste à incorporer dans les zones réparées, le désoxyuridine monophosphate marqué à la biotine, une molécule pour laquelle la streptavidine a une haute affinité. Le complexe biotine-streptavidine confère aux fragments d’ADN marqués de nouvelles propriétés permettant leur purification. Plus précisément, nous avons utilisé des fibroblastes humains normaux endommagés avec les rayons UV, que nous avons perméabilisés puis incubés en présence d’ATP, dATP, dGTP, [³H]dCTP et biodUTP pour permettre la synthèse réparatrice. L’ADN a ensuite été purifié, fragmenté par sonication en fragments d’environ 150 pb puis incubé avec la streptavidine (Kd du complexe biotine libre-streptavidine 10^-15) ayant une densité de 1,33 g/ml dans le CsTFA comparé à 1,6 g/ml pour l’ADN non-marqué. La centrifugation isopycnique résulte en la séparation des fragments d’ADN réparés et marqués à la biotine de ceux non-réparés. Cette méthode est applicable pour tous types de dommages à l’ADN réparés par la voie d’excision-resynthèse incluant les dommages causés par les carcinogènes chimiques et les radiations ionisantes.

Abstract

We have developed a method for purifying DNA fragments containing excision repair patches which involves incorporation of biotinated deoxyuridine monophosphate into repair patches followed by isolation of biotin-containing DNA fragments using streptavidin and isopycnic density gradient centrifugation. Normal human fibroblasts were damaged with UV radiation, rendered permeable and allowed to perform repair synthesis in the presence of ATP, dATP, dGTP, [³H]dCTP and biotinated deoxyuridine triphosphate. The DNA was purified, sonicated to a number-average molecular weight of 150 bp, then incubated with streptavidin, a protein with a high affinity for biotin and with a density of 1.33 g/ml in cesium trifluoroacetate compared to 1.6 g/ml for DNA. Isopycnic centrifugation in cesium trifluoroacetate resulted in the separation of the streptavidin-DNA complex with little or no dissociation. This method is applicable to any type DNA damage repaired by the excision repair pathways in which thymine is present in the repair patches, including damage from chemical carcinogens and ionizing radiation.