Utilisation du deutérium pour l’étude des atomes d’hydrogène échangeables des protéines. Application à la ribonucléase

Commissariat à ΓEnergie Atomique, Département de Biologie, Boite Postale n° 2, 91 -Gif-sur-Yvette, France.

Résumé

On décrit une méthode d’échange isotopique protium- deutérium pour déterminer le nombre d’atomes d’hydrogène échangeables d’une protéine. L’eau provenant du contre- échange entre la protéine deutériée et l’eau naturelle est recueillie par cryosublimation et sa teneur en deutérium est mesurée par spectrométrie de masse.

L’étude, par cette méthode, de la cinétique d’échange de la ribonucléase A montre l’existence d’une trentaine d’atomes difficilement échangeables à pH 4,7 et 38 °C. On atteint le nombre d’atomes théoriquement échangeables soit en élevant la température (GO °C), soit en abaissant le pH (2,4). D’autre part, dans les conditions de formation du dimère sous l’influence de l’acide acétique à 50 %, on obtient immédiatement un échange correspondant au nombre théorique, ce qui conduit à penser que l’anion CD₃COO^-, par sa nature ou par sa concentration, favorise l’accessibilité de certains atomes d’hydrogène de la molécule.

Abstract

A protium-deuterium exchange method is described to measure the number of the exchangeable hydrogen atoms of a protein. Water from back-exchange between the deuteriated protein and light water is collected by cryosublimation and its deuterium content is determined by mass spectrometry.

The exchange kinetics of ribonucléase A studied by this method shows evidence of about thirty hardly exchangeable atoms at pH 4,7 and 38 °C. The number of theoretically exchangeable atoms is reached when temperature is increased (60 °C) or pH decreased (2,4).

On the other hand, in dimer formation conditions with 50 % acetic acid, the theoretical exchange is immediately attained, suggesting that anion CD₃COO^-, through its bulk or concentration, eases the approach of some hydrogen atoms of ribonucléase A.