Determination of hydrodynamic degradation of DNA using flow birefringence techniques

I. — Description of the flow birefringence anomaly

Department of Physics Sir John Cass School of Science and Technology, Jewry Street, London E.C.3., France.

Abstract

Shear degradation experiments on high molecular weight DNA have for the first time been carried out under uniform velocity gradient conditions. Precursory work on a calf thymus sample (molecular weight 31 x 106) indicates that a rate process is operative and that preferential molecular halving occurs. A gradient of 4 x 10⁴ s^-1 produces almost complete halving after shearing for seven minutes. Using an extended chain model for breakage this gradient corresponds to a critical breaking force for the DNA backbone of 1 x 10^-4 dynes, which is an order of magnitude smaller than estimated theoretically. Flow birefringence measurements are reported which indicate that such an extended chain model is unrealistic : a loss in molecular anisometry during flow is implied, manifested in a time dependence anomaly of both birefringence and extinction angle. At high gradients, the extinction angle behaviour is further found to be associated with the molecular degradation which occurs. Extensive investigation of the time dependent anomaly, in an attempt to understand changes in DNA conformation during flow, has eliminated some of the possible mechanisms for this behaviour, such as, induced shear-denaturation, protein cross linkage and wall desorption. Quanlitalively, a molecular weight threshold for the time dependent behaviour of between two and five million has been established.

Résumé

Les expériences de la dégradation de cisaillement sur le DNA au poids moléculaire élevé ont été effectuées pour la première fois sous des conditions de gradient à vitesse uniforme. Le travail préliminaire sur un échantillon de thymus de veau au poids moléculaire 31 X 10₆ indique qu’un processus de taux entre en vigueur, et qu’une division préférentielle de molécule s’y produit. Le gradient de 4 x 10⁴ s^-1 produira une division quasi complète après le cisaillement d’une durée de 7 mn. En utilisant le modèle de chaîne allongée pour la rupture, le gradient correspond à la force critique de la rupture pour la colonne principale de DNA aux dynes 1 x 10^-4, ce qui présente un ordre de grandeur plus petit que celui qu’on a estimé théoriquement. On a signalé des mesures de la biréfrigence d’écoulement qui indiquent qu’un tel modèle de chaîne allongée est irréalisable : il implique la perte d’une anisométrie moléculaire durant l’écoulement. Cette perte se manifeste sur l’anomalie du temps dépendant de la biréfrigence et de l’angle d’extinction, de l’un et de l’autre. En cas de gradients élevés, la conduite de l’angle d’extinction se trouve davantage associée à la dégradation moléculaire qui s’y produit. Pour tenter de comprendre les changements de conformation dans le DNA durant l’écoulement, l’enquête approfondie sur l’anomalie du temps dépendant a éliminé certains mécanismes possibles, par exemple, la dénaturation de cisaillement induit, le chaînage croisé de protéine, et la désorption murale. Quantitativement parlant, un seuil de poids moléculaire de 2 à 5 millions a été établi pour la conduite du temps dépendant.