Durée de vie et polarisation de fluorescence du conjugué sérumalbumine de boeuf-dimétylaminonaphtalène sulfonate

Centre de Recherches sur les Macromolécules, Strasbourg et Centre de Biophysique Moléculaire, Orléans-La-Source. France.

Résumé

On examine les différents facteurs qui déterminent les courbes de dépolarisation de la fluorescence émise par les protéines conjuguées et leur influence sur la mesure de la moyenne harmonique ph, des temps de relaxation. On aborde ensuite l’étude expérimentale d’une série de préparations de sérum-albumine de bœuf conjuguée avec le DNS dont le nombre moyen N de fluorophores par molécule s’étend de 0,6 à 11.

La forme de la décroissance, mesurée à l’aide de la méthode du photoélectron unique dépend de N. Si N est inférieur à 1, on obtient une décroissance exponentielle dont la constante de temps est voisine de 20 ns. Pour des valeurs de N supérieures à 1, la décroissance est complexe et peut être décrite au moyen de la somme de deux exponentielles. La proportion de l'exponentielle de constante courte augmente avec N.

En comparant les courbes de dépolarisation obtenues par variation de température et par addition de saccharose, on montre que l’activation thermique des rotations est négligeable de 0 à 40 °C. L’application de la formule de WEBER aux courbes de dépolarisation thermique donne les résultats suivants :

A pH isoionique, la valeur de P_h ne dépend pas de N, elle est en bon accord avec les dimensions de la molécule telles qu’elles sont déterminées par d’autres techniques physiques.

A pH 2 le temps de relaxation dépend de N. Ce résultat s’explique par l’existence d’un polydispersité de temps de relaxations dont certains sont relativement petits. Dans ces conditions, la formule de WEBER n’est plus valable et fournit un temps de relaxation harmonique apparent d’autant plus grand que la constante de décroissance est élevée.

Enfin, le saccharose semble induire des changements dans la molécule de B.S.A.-DNS, ce qui le rend impropre à la détermination des temps de relaxation de cette substance.

Abstract

Following the method of WEBER, one examines the various factors contributing to the depolarization curves of the fluorescence emitted by the proteins conjugated with fluorophores, and also their influence on the measurement of the harmonic mean рh of the relaxation times. Then one takes up the experimental study of a set of bovine serum albumine conjugated with the DNS of which the average number N of fluorophores per molecule is extending from 0,6 to 11.

The shape of the decay curves measured with the single Photo-electron method depends upon N. If N is smaller than 1, one obtains an exponential decay with a time constant of about 20 ns. For N greater than 1, the decay is complex and can be described by means of the sum of two exponentials. The contribution of the exponential of short time constant, increases with N.

Comparing the depolarization curves obtained in varying the temperature and in adding sucrose, shows that the thermal activation of rotations is negligible from 0 to 40 °C. The follo- wing results have been obtained using the formula of WEBER : isoionic pH, the value is independant of N. That value is in J. CH. PHYS TOME 69 (1969) good agreement with the size of the molecule as determined by the other physical techniques. At pH 2, the relaxation time depends on N. That result is explained by the polydispersity of relaxation times, some of which are relatively small. In these conditions, the formula of WEBER is no longer valid, and gives an apparent relaxation time all the greater as the decay time is high. Finally the saccharose seems to bring about some changes into the molecule of the B.S.A.-DNS which makes its use un fit for determining the relaxation times in those conditions.