Appareil de mesure directe des déclins de fluorescence applicable aux membranes biologiques et à leurs milieux modèles

(Centre de Recherche Paul-Pascal, Domaine Universitaire, 33405 Talence.), France.

Résumé

Dans le but d’obtenir la microviscosité de divers milieux lipidiques membranaires, on a construit un appareil de mesure des déclins de fluorescence qui évite le comptage de photons.

Dans la méthode utilisant la relaxation de rotation de marqueurs fluorescents, la durée de vie est en effet, au même titre que la viscosité, un des facteurs de l’état de dépolarisation de la lumière émise : cette dernière grandeur ne suffit donc pas à la détermination absolue de la viscosité, ni même à sa détermination relative si le milieu est opalescent (membranes naturelles ou reconstituées).

Les déclins de fluorescence obtenus avec notre appareil permettent par ailleurs d’atteindre les coefficients de diffusion latérale et les variations de l’inhibition de fluorescence avec les paramètres thermodynamiques du milieu extérieur à la bicouche.

La mesure de durée de vie des milieux fluorescerts étalons proposés par Clien donne le résultat attendu:

• —

  à 1 % près à 10 nanosecondes,

• —

  à 5 % près à 5 nanosecondes.

La largeur de l’impulsion excitatrice de l’ordre de 2 nanosecondes nécessite une division de convolution qui est responsable de l'augmentation de l’incertitude, que l’on peut évaluer à 25 % autour de 2 nanosecondes.

L appareil a été appliqué à la détermination des constantes de relaxation de rotation en complément de la mesure des taux depolarisation de la lumière émise mais nous ne développons ® (lu’un autre aspect de son utilisation. L’exemple de la mesure de la transition thermique du système binaire dipal- mitoylphosphatidylcholine-eau par l’étude du déclin du pyrène monomère à 390 nm en présence de dimère dynamique montre »enles problèmes posés et les paramètres accessibles quand la décroissance temporelle n’est plus exponentielle.

Ce mémoire constitue une description de référence pour les futures publications des auteurs.

Abstract

In order to get the microviscosity or various lipid or membrane systems we built a device which allows to measure fluorescence decay times without the need of photon counting.

Whith use of fluorescent probes in the rotational relaxation method, the lifetime of the emitting molecules and the surrounding viscosity were observed to be the more important factors of the polarized state of the emitted light : therefore, the latter parameter is insufficient to obtain cither the absolute viscosity or its relative values in a turbid dispersion (natural or model membranes).

Moreover, the fluorescence decays allow to know the lateral diffusion coefficients and the quenching effect variations in terms of the thermodynamical factors of the medium containing the membranes.

The measure of decay times from fluorescent standard solutions (Chen, 1974) gives the expected results with the following inaccuracies :

• —

  1 % around 10 nanoseconds ;

• —

  5 % around 5 nanoseconds.

Because the width of the exciting pulse is about 2 nanoseconds the division of convolution increases the inaccuracy to 25 % within this time range.

This experimental device was applied to the determination of rotation relaxation coefficient is conjunction with the measure of the degree of polarization. Another example is developped : the phase transition of aqueuous dispersion of dipalmitoylphosphatidylclioline by quenching of pyrene monomer in the presence of his dynamical excimer.