Optimisation of Arabidopsis thaliana DNA extraction for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine formation after gamma irradiation

¹ Département de Recherche Fondamentale sur la Matière Condensée, SCIB, Laboratoire des Lésions des Acides Nucléiques, CEA Grenoble, 17 avenue des Martyrs, 38054 Grenoble cedex 9, France
² Département d'Ecophysiologie Végétale et de Microbiologie, Laboratoire de Radiobiologie Végétale, CEA Cadarache, 13108 Saint Paul Lez Durance, France

Abstract

8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) is a major oxidative DNA lesion. Plant DNA extraction protocols were improved in order to quantify 8-oxodGuo in the overall DNA of a cell suspension of Arabidopsis thaliana using the method of high performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-EC). Our results show that DNA can be artefactually oxidised during the extraction procedure. Metal chelating agents were efficient to decrease the 8-oxodGuo background level to -oxodGuo/105Gua and to improve experiment reproducibility. It was observed that DNA guanine oxidation in plant cells by γ-rays is very low in vivo (15 8-oxodGuo/10⁹Gua formation per Gy).

Résumé

La 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodGuo) est une lésion oxydative majeure de l'ADN. Divers protocoles d'extraction d'ADN végétal ont été optimisés dans le but de quantifier la 8-oxodGuo dans l'ADN total d'une suspension cellulaire d'Arabidopsis thaliana en utilisant la chromatographie liquide haute pérformance couplée à un détecteur électrochimique (CLHP-EC). Nos résultats montrent que l'ADN peut être oxydé artéfactuellement au cours de son extraction. L'utilisation de chélateurs de métaux permet de réduire le niveau de base de 8-oxodGuo à 3,3±0,1 8-oxodGuo/10⁵Gua et d'augmenter la reproductibilité des expériences. L'étude des effets des rayons γ sur les cellules de plantes a mis en évidence que l'oxydation de la guanine de l'ADN est très faible in vivo (formation de 15 8-oxodGuo/10⁹Gua par Gy).