Sur la constitution chimique des sites actifs de certains métalloenzymes

X. — Le pouvoir catalytique des complexes-modèles sur l’oxydation du phénol par l’oxygène moléculaire

Institut de biologie physico-chimique, 13, rue Pierre-et-Marie-Curie, Paris, 5 e., France.

Résumé

Comme dans les mémoires précédents, nous étudions les complexes métalliques qui peuvent servir comme modèles du centre actif de certains métallo-enzymes. Les complexes de cuivre, formés uniquement avec des ligands analogues à ceux qui se trouvent sur les chaînes latérales des protéines, nous servent à étudier la capacité catalytique d’oxyder les monophénols par l’oxygène moléculaire. En procédant à des essais avec des combinaisons diverses de ligands, nous dégageons l'influence de chacun d’eux. La capacité catalytique de presque tous les complexes est pratiquement nulle.

Le complexe de loin le plus actif est constitué par une molécule d’imidazole par atome de cuivre, avec des ligands ioniques les radicaux acétate et phénolate (ou p-crésolate). (Complexe C — A₁) Ces ligands correspondent aux restes d’histidine, des acides aminés bibasiques et de la tyrosine. L’acétate joue un rôle indispensable, ainsi que l'imidazole.

Ce complexe actif oxyde le p-crésol, où la position para est bloquée, avec la même vitesse et avec la même cinétique que le phénol ordinaire. Les produits bruts d’oxydation donnent la réaction des quinones et des peroxydes de phénol. Ils n’ont pas pu être isolés à l’état pur à cause de leur labilité. Cette labilité se retrouve aussi chez les o-quinones. Aussi nous admettons que le complexe oxyde le phénol en position ortho, comme la tyrosinase.

La capacité catalytique du complexe va de pair avec le transfert de charge du phénol sur le cuivre et, en présence d’imidazole, du phénol sur l’imidazole, via cuivre. Il est mis en évidence par une bande de transfert de charge et par l’aptitude qu’acquiert le Cu++, en présence du phénol, de réagir avec le réactif spécifique du Cu+. Tout se passe comme si le Cu++ devenait, en présence du phénol, « monovalent ». On met en évidence le rôle particulier des groupes carboxyle et imidazole dans le processus de transfert de charge. Ce processus se produit aussi bien en présence qu’en absence de l'oxygène, et il est réversible par simple scission de la liaison métal- phénol, sans formation du Cu+ libre, non lié au phénol.

Les sels ferriques présentent, en présence du phénol, le même processus de transfert. Mais les complexes de fer ou d’autres métaux, analogues à celui du cuivre, n’ont aucune activité catalytique sur l’oxydation du phénol par l’oxygène, en confirmant ainsi la spécificité du cuivre, qu’on retrouve avec la tyrosinase.

Abstract

As in previous papers, we report here the study of metallic complexes which may be taken as models for the active center of some metalloenzymes. Copper complexes formed only with those ligands as may be found on protein side chains are studied in relation to the catalytic oxidation of monophenols by molecular oxygen. By carrying out assays with diverse combinations of ligands, we determined the influence of each of them. The catalytic capacity of almost all the complexes is practically nil.

The most active complex so far is constituted by one molecule of imidazole per Cu atom, containing acetate and phono- late (or p-cresolate) as ionic ligands (complex C — A₁). These ligands correspond to the histidine, dibasic amino acids and tyrosine side chain residues. Acetate plays an indispensable role, like that of imidazole.

The active complex oxidises p-cresol, in which the para position is blocked, with the same speed and kinetic pattern as the ordinary phenol. The crude products of oxidation give the reaction for quinones or peroxides of phenol. These products could not be isolated in a pure state because of their high lability. This lability is one of caracteristic properties of o-quinones. Hence we presumed that the complex oxidises phenol in the ortho position, like tyrosinase.

The catalytic capacity of the complex goes together with the charge transfer taking place from phenol to the copper and, in the presence of imidazole, from phenol to imidazole via copper. Evidence for this charge transfer is provided by the appearance of a charge transfer band and by the aptitude of Cu++ to react, in presence of phenol, with the reagent specific for Cu+. Every thing happens as if the Cu++ becomes, in the presence of phenol « monovalent ». The particular role of carboxyle and of imidazole in the charge transfer, has been brought into light. This process occurs as well in the presence of oxygen as in its absence, and is reversed by simple breaking the metal-phenol bond, without the formation of free Cu+, uncombined with phenol.

Ferric salts show, in the presence of phenol, the same process of transfer, but the complexes of iron or other metals, analogous to the active copper complex, do not posses any activity on the oxidation of phenol by oxygen, thus confirming tlie specificity of copper, like that observed in tyrosinase.